題目：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)治療增生性疤痕的潛在藥物

英文名：Using network pharmacology to discover potential drugs for hypertrophic scars

雜志：The British journal of dermatology

影響因子：11

發(fā)表時間：2024年5月

研究背景：外傷、手術(shù)、燒傷和蚊蟲叮咬都會造成皮膚損傷，并可能導(dǎo)致被稱為“增生性”疤痕的厚而隆起的疤痕。肥厚性瘢痕是一種因成纖維細胞過度增殖而導(dǎo)致皮膚異常纖維化的疾病?，F(xiàn)有藥物的治療效果并不理想。探索增生性疤痕的分子發(fā)病機制，篩選治療增生性疤痕的有效藥物具有重要意義。

研究思路：利用數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的人肥厚性瘢痕RNA測序數(shù)據(jù)，通過加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）尋找與肥厚性瘢痕相關(guān)的基因模塊和關(guān)鍵基因。在化合物庫中篩選候選化合物。通過分子對接篩選潛在藥物，并在人類肥厚性瘢痕成纖維細胞和小鼠機械力增生性瘢痕模型中進行驗證。

研究結(jié)果：

1、WGCAN分析揭示了肥厚性瘢痕中的重要基因模塊

通過對10個增生性疤痕樣本和5個正常疤痕樣本進行WGCNA分析，我們發(fā)現(xiàn)增生性疤痕中有6個重要的基因模塊（圖1a、b）。黑色模塊（n=648個基因；P=0.04，GS=0.53）與增生性瘢痕呈正相關(guān)，而青色模塊（n=361個基因；P=0.00004，GS=-0.86）、藍色模塊（n=3764個基因；P=0.003，GS=-0.86）、黑色模塊（n=648個基因；P=0.04，GS=0.53）與增生性瘢痕呈負相關(guān)、GS=-0.7）、royal藍（n=134個基因；P=0.006，GS=-0.67）、綠松石色（n=1758個基因；P=0.009，GS=-0.65）和淡青色模塊（n=481個基因；P=0.01，GS=-0.63）與增生性瘢痕呈負相關(guān)（圖1c）。GO和KEGG富集分析揭示了不同模塊中基因的功能。在黑色模塊中，基因與粘連接頭和能量代謝有關(guān)。青色模塊與肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)、Ras信號通路和細胞因子受體活性有關(guān)。藍色模塊與病灶粘附、緊密連接、ECM受體相互作用、Rap1信號通路和細胞骨架的結(jié)構(gòu)成分有關(guān)。在royal藍模塊中，基因與鈣信號途徑、Wnt信號途徑和皮膚表皮的結(jié)構(gòu)成分有關(guān)。綠松石色模塊顯示與細胞代謝和TGF-β信號通路有關(guān)，而淡青色模塊則與過氧物酶體和氧化酶有關(guān)（圖1d）。

圖1

2、連接圖數(shù)據(jù)庫和分子對接篩選出治療肥厚性瘢痕的潛在藥物

如上所述，對發(fā)現(xiàn)的6個重要模塊中意義highest的300個基因進行PPI分析。結(jié)果表明，ITGB1是樞紐蛋白（圖2a）。整合素是一種跨膜蛋白，與細胞內(nèi)的應(yīng)力纖維和周圍的ECM相關(guān)。以往的研究表明了整合素在纖維化中的重要作用，它能響應(yīng)機械張力信號并介導(dǎo)TGF-β功能。

利用CMAP數(shù)據(jù)庫對這300個基因進行分析，篩選出最重要的50種候選藥物。對50種候選藥物和ITGB1進行了蛋白質(zhì)-分子對接計算。9種對接能量較低的藥物被選為治療肥厚性瘢痕的潛在藥物：恩扎司他林（-7.7kcal/mol）、SU11274（-7.5kcal/mol）、林西替尼（-7.5kcal/mol）、索拉非尼（-7.5kcal/mol）、伊馬替尼（-7.4kcal/mol）、克唑替尼（-7.1kcal/mol）、莫美羅替尼（-7.1kcal/mol）、TAS-301（-7kcal/mol）和他克莫司（-7kcal/mol）（圖2b）。

對這九種候選化合物進行了qPCR實驗。用每種化合物10μmol/L培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞1、3和7天。結(jié)果顯示，第1天，ITGB1的表達減少，第3天，TGF-β1的表達減少，第7天，COL1A1、DCN和TGF-β1的表達減少（圖2c）。其他六個化合物處理組的基因表達未見明顯變化。因此，克唑替尼、索拉非尼和SU11274被選為治療增生性瘢痕的潛在藥物。

圖2

3、克唑替尼、索拉非尼和SU11274可降低增生性瘢痕成纖維細胞在體外的遷移能力

為了研究三種候選藥物對人皮膚成纖維細胞遷移的抑制作用，使用1、5和10μmol/L的克唑替尼、索拉非尼和SU11274進行了傷口愈合實驗。藥物處理與傷口面積之間存在明顯的相關(guān)性。劑量依賴性與對照組相比，三種藥物處理組（1-10μmol/L）在24、48和72小時內(nèi)的傷口愈合速度都有所下降，這表明三種候選藥物都能顯著降低人皮膚成纖維細胞的遷移能力（圖3）。

圖3

4、克唑替尼、索拉非尼和SU11274可抑制肥厚性瘢痕成纖維細胞增殖并下調(diào)纖維化相關(guān)蛋白

抑制成纖維細胞增殖可以緩解瘢痕肥大。因此，作者研究了克唑替尼、索拉非尼和SU11274能否抑制人皮膚成纖維細胞在體外的過度增殖。結(jié)果顯示，藥物治療明顯影響了人皮膚成纖維細胞的增殖：1μmol/L的克唑替尼、索拉非尼和SU11274對抑制HSF增殖無效，但在5μmol/L和10μmol/L的濃度下，增殖受到明顯抑制。還對正常成纖維細胞的增殖指數(shù)進行了評估，發(fā)現(xiàn)其增殖指數(shù)低于HSF。用10μmol克唑替尼和SU11274處理將人皮膚成纖維細胞的增殖指數(shù)降低到與正常成纖維細胞相似的水平（圖4a）。

用10μmol克唑替尼、索拉非尼和SU11274處理人皮膚成纖維細胞3天后，對其進行了Western印跡檢測。結(jié)果表明，克唑替尼能顯著降低α-SMA、COL1A1、ITGB1和TGF-β的表達。索拉非尼和SU11274也能明顯降低α-SMA和COL1A1的水平，但不能降低ITGB1或TGF-β的水平（圖4b）。

圖4

5、克唑替尼和整合素β1小干擾RNA可減輕小鼠肥厚性瘢痕的形成

根據(jù)已公布的手術(shù)方案，建立了小鼠增生性疤痕模型；小鼠皮下注射三種候選藥物。使用ITGB1 siRNA 驗證ITGB1的樞紐功能。比較實驗組和對照組小鼠的疤痕總面積。接受克唑替尼、索拉非尼、SU11274 和 ITGB1 siRNA治療的小鼠的疤痕面積均顯著減少。然而，克唑替尼的抑制作用（圖5a）。疤痕隆起通過血紅素和伊紅染色進行評估。疤痕隆起指數(shù)定義為 “D/d ”比值，“D”代表疤痕的厚度，“d”代表鄰近正常皮膚的厚度。結(jié)果表明，與對照組相比，使用克唑替尼、索拉非尼、SU11274和ITGB1 siRNA治療的小鼠的瘢痕增生指數(shù)均顯著降低。此外，克唑替尼對瘢痕增生的抑制能力明顯高于索拉非尼和 SU11274，索拉非尼和 SU11274 對瘢痕增生的抑制效果無明顯差異（圖 5b）。此外，還使用馬森三色染色法測定了瘢痕橫截面積的變化。與對照組相比，接受克唑替尼、索拉非尼、SU11274 和 ITGB1 siRNA 治療的小鼠的橫截面瘢痕面積明顯縮小?？诉蛱婺嶂委熃M的瘢痕橫截面積也小于索拉非尼和 SU11274 治療組，索拉非尼和 SU11274 治療組之間沒有明顯差異（圖 5c）。研究結(jié)果表明，與索拉非尼和 SU11274 相比，克唑替尼對抑制疤痕形成的效果最好。研究還表明，ITGB1 siRNA 可減輕小鼠瘢痕的形成。

圖5

6、靶點預(yù)測表明，克唑替尼可影響肥厚性瘢痕信號通路

利用DrugBank和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，預(yù)測了克唑替尼的100個藥理靶點，每個靶點的概率都超過了0.9；在肥厚性瘢痕的6個重要模塊中發(fā)現(xiàn)了36個基因：黑色模塊中有7個目標，青色模塊中有1個目標，藍色模塊中有20個目標，royal藍色模塊中有2個目標，綠松石模塊中有6個目標。

GO分析表明，克唑替尼的藥理靶點與跨膜受體蛋白激酶活性、生長因子結(jié)合、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性、支架蛋白結(jié)合有關(guān)、表皮生長因子（EGF）受體（EGFR）結(jié)合、整合素結(jié)合和肌動蛋白單體結(jié)合（圖6a）。KEGG分析表明，藥理靶點與MAPK信號通路、磷酸肌酸3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路、Ras信號通路、粘連接頭、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑抗性、局灶性粘連、肌動蛋白單體結(jié)合（圖6a）有關(guān)、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑抗性、病灶粘附、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)、TGF-β信號通路和Janus激酶（JAK）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號通路（圖6b）?？诉蛱婺岬乃幚戆悬c包括TGF-β、integ-rin結(jié)合和其他經(jīng)典的肥厚性瘢痕相關(guān)信號通路；因此，克唑替尼可能是一種有效的抗肥厚性瘢痕藥物。

圖6

總結(jié)：本文通過WCGNA、PPI、分子對接和藥物數(shù)據(jù)庫分析方法，篩選出增生性瘢痕的高相關(guān)性基因以及潛在的治療藥物，并在體外做了驗證。思路常規(guī)，非常容易復(fù)現(xiàn)，生信越來越成為低成本探索科學(xué)問題的工具！傲星生物提供多種高階生信分析方案，另有完善的下游驗證、機制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！