題目：通過代謝組學(xué)分析、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)模擬鑒定紫蘇葉中對(duì)抗高尿酸血癥的抑制劑

英文名：Identification of inhibitors from a functional food-based plant Perillae Folium against hyperuricemia via metabolomics profiling, network pharmacology and all-atom molecular dynamics simulations

雜志：frontiers in Endocrinology

影響因子：3.9

發(fā)表時(shí)間：2024年2月16日

研究背景：高尿酸血癥（HUA）是一種由嘌呤代謝功能障礙引起的代謝紊亂，其中嘌呤水平升高可部分歸因于海鮮消費(fèi)。紫蘇葉（PF）歷來被用于緩解海鮮引起的疾病。然而，其對(duì)HUA的療效和潛在機(jī)制仍不清楚。

研究思路：進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析以確定PF治療HUA所涉及的候選靶點(diǎn)和潛在機(jī)制。通過基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析預(yù)測潛在機(jī)制。在AutoDockVina和PyRx中進(jìn)行分子對(duì)接，以預(yù)測草藥化合物與HUA相關(guān)靶點(diǎn)之間的結(jié)合親和力。通過分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬、文本挖掘和非靶向代謝組學(xué)分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這些抑制劑在HUA中的作用。

圖1

研究結(jié)果：

1、紫蘇葉治療高尿酸血癥的草藥化合物及潛在靶點(diǎn)

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，并得到了18個(gè)靶點(diǎn)，包括黃嘌呤脫氫酶(XDH)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP3)、單胺氧化酶A型(MAOA)、線粒體醛脫氫酶(ALDH2)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、Caspase-凋亡酶(Caspase-凋亡酶)8(CASP8)、過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARG)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、趨化因子（C-X-C矩陣）配體8(CXCL8)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活因子3(STAT3)、前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、腎素（REN）、雌激素（ESR1）、白蛋白（ALB）、5-羥色胺受體2A（HTR2A）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）和白細(xì)胞介素6（IL6）（圖2A）。根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫中的25個(gè)候選靶點(diǎn)構(gòu)建了一個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2B）。如圖2B所示，這些靶標(biāo)被分為紅色、綠色和藍(lán)色三組。該網(wǎng)絡(luò)的25個(gè)節(jié)點(diǎn)之間有102條邊，每個(gè)節(jié)點(diǎn)至少與一個(gè)其他節(jié)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)。

圖2

2、紫蘇葉參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑

為闡明化合物-靶標(biāo)相互作用的可能機(jī)制，進(jìn)行了GO和KEGG富集分析，在15個(gè)通路中，癌癥通路的基因比例maximum（圖2C）。在GO分析中，通過BP、CC和MF分析對(duì)25個(gè)潛在靶標(biāo)進(jìn)行了注釋，并根據(jù)p值將相應(yīng)的術(shù)語從小到大排序（圖2D）。根據(jù)CC分析（圖2D），細(xì)胞外區(qū)域部分、細(xì)胞頂端部分、細(xì)胞外區(qū)域、質(zhì)膜區(qū)域、膜筏、膜微域、頂端質(zhì)膜、膜區(qū)域、質(zhì)膜部分、基底側(cè)和質(zhì)膜被確定為前十大類別。

3、評(píng)估與高尿酸血癥蛋白對(duì)接的紫蘇葉化合物

為了根據(jù)相應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)探索PF化合物是否與HUA的潛在靶點(diǎn)存在生物學(xué)聯(lián)系，328種成分與25種HUA靶點(diǎn)進(jìn)行了對(duì)接蛋白質(zhì)，產(chǎn)生了8200個(gè)對(duì)接結(jié)果，結(jié)合得分最好的前10個(gè)靶點(diǎn)是ZH01（XDH）、ZH02（MMP3）、ZH24（ABCC1）、ZH03（MAOA）、ZH15（ALB）、ZH23（SLC22A8）、ZH22（SLC22A6）、ZH16（HTR2A）、ZH12（PTGS2）、和ZH05（MAPK8）。其中，XDH的平均結(jié)合能minimum（-6.76kcal/mol），表明XDH與328個(gè)PF化合物結(jié)合良好。在直方圖中，根據(jù)平均結(jié)合親和力對(duì)25個(gè)目標(biāo)物進(jìn)行了排序，并將其分為四組（圖3）。具體來說，(I)組對(duì)應(yīng)的是排名前一至四位的靶標(biāo)，而其余21個(gè)靶標(biāo)則平均分為三組，即(II)組、(III)組和(IV)組。如圖3所示，至少有一種配體與（I）組至（III）組的靶標(biāo)具有高親和力（結(jié)合分?jǐn)?shù)≤-9kcal/mol），有20多種配體對(duì)ZH01（only的一種）具有類似的作用。此外，大多數(shù)化合物（超過50%）與(I)組和(II)組目標(biāo)物的對(duì)接親和力為間歇性（-9至-6kcal/mol）。相反，大多數(shù)化合物與（III）類和（IV）類靶標(biāo)的結(jié)合親和力較弱（>-6kcal/mol），特別是ZH09和ZH17，它們的結(jié)合配體數(shù)都約為300（91.4%）。

圖3

4、化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)揭示了潛在的多靶標(biāo)多活性化合物機(jī)制

根據(jù)化合物的結(jié)合能，選出了每個(gè)靶標(biāo)的前10個(gè)活性化合物。剔除重復(fù)的化合物后，共保留了32個(gè)活性化合物來構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)（圖4）。在32個(gè)活性化合物中，有24個(gè)與一個(gè)以上的靶點(diǎn)表現(xiàn)出良好的結(jié)合能力。有10種化合物與25個(gè)靶點(diǎn)中一半以上的靶點(diǎn)結(jié)合良好。值得注意的是，ZS059和ZS058的度值均為21。上述發(fā)現(xiàn)可能凸顯了PF對(duì)HUA的協(xié)同作用，其特點(diǎn)是多靶點(diǎn)和多組分機(jī)制。

圖4

5、根據(jù)328種化合物的結(jié)構(gòu)及其親和力進(jìn)行聚類分析至XDH

隨后對(duì)328種PF化合物進(jìn)行了基于結(jié)構(gòu)的分析。如圖5a所示，大多數(shù)PF化合物與這兩種抑制劑的相似性較弱。在圖5B中，328種化合物根據(jù)其相應(yīng)的結(jié)合能以不同顏色顯示為節(jié)點(diǎn)。值得注意的是，maximum聚類中的節(jié)點(diǎn)往往呈紫紅色，這表明它們通常具有良好的結(jié)合親和力（圖5B）。

圖5

6、五種與XDH有強(qiáng)烈相互作用的配體具有類似于藥物的性質(zhì)，并且非有毒分子

為了進(jìn)一步探索哪些成分更有可能成為HUA的潛在抑制劑，考慮了一些參數(shù)，包括泛檢測干擾化合物（PAINS）、氫鍵（H-bonds）、結(jié)合親和力和ADMET特性。經(jīng)過篩選，確定了5個(gè)合格化合物，包括ZS025、ZS056、ZS090、ZS093和ZS252。如圖6所示，ZS090與XDH形成了一種而ZS025、ZS056和ZS093則在同一區(qū)域形成了兩個(gè)H鍵。除了在兩個(gè)活性位點(diǎn)殘基（Gln1195和Arg913）上形成H鍵外，ZS252還通過不利的供體-供體鍵與Ser1081相互作用，距離分別為2.25a、2.85a和1.14?。

圖6

7、分子動(dòng)力學(xué)模擬五種潛在抑制劑

如圖7所示，利用結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)量（包括RMSD、RMSF、Rg、SASA和氫鍵數(shù)量）分析了六個(gè)模擬系統(tǒng)的構(gòu)象穩(wěn)定性和靈活性。如圖7A所示，蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物在系統(tǒng)弛豫后約10ns達(dá)到平衡，這一點(diǎn)從曲線在此時(shí)間后形成高原可以看出。這表明ZS025具有更高的穩(wěn)定性、與XDH活性位點(diǎn)上的其他配體相比，它在很大程度上保留了其初始結(jié)構(gòu)（圖7B）。對(duì)于Rg和SASA，用Rg測得的蛋白質(zhì)構(gòu)象隨時(shí)間的變化見圖7C，用SASA測得的變化見圖7D。如圖7E和F所示，RMSF和RMSF計(jì)算的變化主要集中在Thr750至Val1333之間的結(jié)合位點(diǎn)殘基上。大部分峰值都位于環(huán)狀區(qū)域周圍，并且相互高度重疊。此外，波谷也呈現(xiàn)出類似的趨勢，尤其是配體結(jié)合型結(jié)構(gòu)。

圖7

8、根據(jù)文獻(xiàn)挖掘和非靶向代謝組學(xué)研究，證明黃芩苷是一種潛在的XDH抑制劑

為了找到這五種化合物在體外和體內(nèi)對(duì)尿酸產(chǎn)生生物效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)，在PubMed、Scopus和CINAHL的基礎(chǔ)上進(jìn)行了文本挖掘分析。搜索的記錄來自最早的可用記錄至2023年6月28日。查詢框中添加的關(guān)鍵詞包括黃芩苷、芐基alpha-mannopyranoside、鄰苯二甲酸二異丁酯、欖香素、鄰苯二甲酸二異丁酯、(3R)-羥基-beta-酮、高尿酸血癥、尿酸、黃嘌呤氧化酶和黃嘌呤脫氫酶?？紤]了所有可用的關(guān)于這五種潛在化合物的英文體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究。剔除重復(fù)結(jié)果后，剩下10條記錄可供進(jìn)一步分析。四篇已發(fā)表的文章中都報(bào)道了黃芩苷。這些論文的結(jié)果主要基于體外研究，所進(jìn)行的研究主要是黃嘌呤氧化酶抑制活性測定。然而，除黃芩苷外，其余四種化合物在作者的鑒定研究中未見報(bào)道。此外，作者還比較了這五種抑制劑與非布索坦的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示ZS025的相似度highest，為0.50877，呈淺黃色。這一發(fā)現(xiàn)也與上述結(jié)果（圖5a）一致。基于上述發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步研究中重點(diǎn)關(guān)注了ZS025。隨后，為了證實(shí)ZS025存在PF顆粒的混合物中，使用UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)分析。在質(zhì)譜結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了543個(gè)分子。在這543個(gè)分子中，有22個(gè)與從中醫(yī)藥信息平臺(tái)數(shù)據(jù)庫中檢索到的分子相吻合，如迷迭香酸、黃芩苷、魚腥草素、木犀草素7-O-beta-D-葡萄糖苷和木犀草素。

圖8

9、黃芩苷-XDH復(fù)合物200ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬

圖9A-F描述了時(shí)間序列分析結(jié)果比較了apoXDH蛋白和黃芩苷結(jié)合的XDH蛋白。黃芩素在大約20ns的平衡后保持了相似的RMSD、Rg和SASA值，平均值分別為0.213nm、3.21nm和489.2?2。這些結(jié)果與apo-XDH蛋白的結(jié)果差別不大：RMSD為0.218nm，Rg為3.22nm，SASA為489.5?2。從圖9A-C中的RMSD、Rg和SASA值可以看出，與沒有配體的情況相比，在這個(gè)較長的模擬過程中，與黃芩素結(jié)合的蛋白質(zhì)折疊更緊湊、更穩(wěn)定。此外，隨著模擬時(shí)間的延長，氫鍵頻率的增加也反映了進(jìn)一步緊密結(jié)合的可能性。最初，平均1-2個(gè)氫鍵可穩(wěn)定黃芩素的結(jié)合。大約75ns后，氫鍵增加到3-4個(gè)，如圖9E中的高密度粗帶所示。雖然圖9F中0.35nm范圍內(nèi)的鍵對(duì)數(shù)量在系統(tǒng)弛豫20ns后不久略有下降，但波動(dòng)的幅度和程度保持一致，呈正弦波趨勢。如圖9H所示，黃芩苷（橙色）與XDH（藍(lán)色）結(jié)合的快照從模擬的初始階段到最后階段都顯示配體與XDH活性位點(diǎn)緊密結(jié)合。圖9G中的每個(gè)殘基RMSF圖也支持時(shí)間序列分析，表明與黃芩素結(jié)合后XDH活性位點(diǎn)殘基的穩(wěn)定性更高，波動(dòng)更小。

圖9

總結(jié)：本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析確定PF治療HUA所涉及的候選靶點(diǎn)和潛在機(jī)制，并在分子水平上充分闡明了黃芩苷作為黃嘌呤脫氫酶抑制劑的巨大潛力，為未來的藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)帶來了希望。