題目：紅景天苷通過SCD1介導(dǎo)的脂肪生成和NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白自噬使三陰性乳腺癌對鐵死亡敏感

英文名：Salidroside sensitizes Triple-negative breast cancer to ferroptosis by SCD1-mediated lipogenesis and NCOA4-mediated ferritinophagy

雜志：Journal of Advanced Research

影響因子：11.4

發(fā)表時間：2024年9月29日

研究背景：陰性乳腺癌（TNBC）是女性乳腺癌死亡的主要原因。文獻(xiàn)已證實(shí)紅景天苷（Sal）在治療TNBC中的益處。然而，關(guān)于Sal治療TNBC的潛在治療靶點(diǎn)和機(jī)制的研究仍然有限。本研究旨在探討Sal抗TNBC的主要靶點(diǎn)和潛在機(jī)制。

研究思路：整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法策略，以研究Sal在TNBC中的作用、潛在靶點(diǎn)和機(jī)制。選用MDA-MB-231細(xì)胞和荷瘤裸鼠進(jìn)行體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。采用CCK-8、LDH檢測和鈣黃綠素-AM/PI染色測定細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性。使用谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛（MDA）、C11-BODIPY581/591探針和FerroOrange染料檢測抗氧化防御、脂質(zhì)過氧化和鐵代謝。通過過表達(dá)谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）或硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）以及敲低核受體共激活因子4（NCOA4）來論證Sal對TNBC的作用機(jī)制。預(yù)測結(jié)果證實(shí)，在Sal和TNBC中鑒定出22個鐵死亡相關(guān)基因，表明Sal作用于TNBC的潛在機(jī)制與鐵死亡相關(guān)。此外，功能富集分析顯示這些基因主要參與mTOR、PI3K/AKT和自噬信號通路。體外驗(yàn)證結(jié)果表明，Sal通過調(diào)節(jié)鐵死亡抑制TNBC細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平升高和脂質(zhì)過氧化。機(jī)制上，Sal通過抑制PI3K/AKT/mTOR軸使TNBC細(xì)胞對鐵死亡敏感，從而抑制SCD1介導(dǎo)的單不飽和脂肪酸脂肪生成以誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，同時促進(jìn)NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白自噬以增加細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量。GPX4或SCD1過表達(dá)或NCOA4缺失的結(jié)果進(jìn)一步支持了我們的機(jī)制研究。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Sal通過誘導(dǎo)鐵死亡對減緩腫瘤生長至關(guān)重要。

圖1

研究結(jié)果：

1、Sal和三陰性乳腺癌（TNBC）相關(guān)靶點(diǎn)集合

為了獲得紅景天苷（Sal）的作用靶點(diǎn)，以“紅景天苷”為關(guān)鍵詞搜索藥物相關(guān)數(shù)據(jù)庫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，排除重復(fù)項(xiàng)后，共剩下178個靶點(diǎn)（圖2A）。隨后，通過條件篩選獲得了1374個三陰性乳腺癌（TNBC）相關(guān)靶點(diǎn)（圖2B）。

圖2

2、三陰性乳腺癌中差異表達(dá)基因及關(guān)鍵模塊基因的鑒定

為了提高結(jié)果的可靠性，從TCGA和GEO數(shù)據(jù)集下載了三陰性乳腺癌（TNBC）樣本進(jìn)行差異表達(dá)基因（DEG）分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TCGA樣本中識別出5252個差異表達(dá)基因，其中2666個下調(diào)的差異表達(dá)基因和2586個上調(diào)的差異表達(dá)基因（圖2C-D）。同時，在GEO數(shù)據(jù)集中進(jìn)行了差異表達(dá)基因分析。然后為所有數(shù)據(jù)集生成主成分分析（PCA）圖（圖2E-F）。此外，確定了2707個差異表達(dá)基因，其中包括1340個下調(diào)的差異表達(dá)基因和1367個上調(diào)的差異表達(dá)基因（圖2G-H）。

為了識別與三陰性乳腺癌（TNBC）相關(guān)的關(guān)鍵模塊，對TCGA-TNBC樣本進(jìn)行了加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）（圖2I）。此外，確定了14個模塊，其中棕色模塊與三陰性乳腺癌高度相關(guān)（圖2J）。此外，散點(diǎn)圖顯示棕色模塊與三陰性乳腺癌之間存在顯著關(guān)系（cor=0.83， p < 1e ? 200）（圖2K）。因此，通過將WGCNA的棕色模塊相關(guān)基因與Limma鑒定的差異表達(dá)基因相交，獲得了1442個基因（圖2L）。GEO數(shù)據(jù)集顯示軟閾值冪為3，對應(yīng)未縮放拓?fù)鋽M合指數(shù)達(dá)到0.88（圖2M）。確定了六個模塊，棕色模塊與三陰性乳腺癌高度相關(guān)（圖2N）。此外，散點(diǎn)圖顯示藍(lán)色模塊與三陰性乳腺癌之間存在正顯著關(guān)系（cor=0.88，p<1e?200）（圖2O）。因此，通過將WGCNA的棕色模塊相關(guān)基因與Limma鑒定的差異表達(dá)基因相交，獲得了680個基因（圖2P）。

3、預(yù)測和實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果闡明Sal通過促進(jìn)鐵死亡抗三陰性乳腺癌

此外，通過疾病、TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫的交集獲得了3296個三陰性乳腺癌相關(guān)基因（圖3A）。Sal基因與三陰性乳腺癌基因的交集獲得了75個共有基因（圖3B）。為了探索Sal對三陰性乳腺癌的潛在作用機(jī)制，利用GeneMANIA工具對75個共有基因進(jìn)行功能分析。結(jié)果顯示，共有基因主要參與與氧化應(yīng)激、氧化應(yīng)激反應(yīng)、氧化應(yīng)激下的細(xì)胞死亡、脂質(zhì)生物合成過程的調(diào)節(jié)以及脂質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)等過程（圖3C）。鐵死亡是一種由脂質(zhì)過氧化和氧化還原失衡驅(qū)動的鐵依賴性程序性細(xì)胞死亡形式[36]。在引起細(xì)胞氧化應(yīng)激的因素中，膜雙層中脂質(zhì)的氧化修飾，特別是脂質(zhì)過氧化，已成為細(xì)胞命運(yùn)的重要調(diào)節(jié)因子。廣泛的脂質(zhì)過氧化通過一種稱為鐵死亡的獨(dú)特細(xì)胞死亡機(jī)制使細(xì)胞死亡[37]。因此，我們推測Sal抗三陰性乳腺癌的潛在機(jī)制可能與鐵死亡有關(guān)。

最初，我們在MDA-MB-231細(xì)胞中驗(yàn)證了Sal對三陰性乳腺癌（TNBC）的作用。觀察到Sal抑制細(xì)胞活性與治療的劑量和時間相關(guān)（補(bǔ)充圖S1）?；诖耍x擇了Sal的IC₅₀進(jìn)行進(jìn)一步研究。此外，鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin可以抑制細(xì)胞活性與治療劑量相關(guān)（圖3D）。相反，這種作用可以被Fer-1逆轉(zhuǎn)（圖3E），表明MDA-MB-231細(xì)胞中發(fā)生了鐵死亡。我們進(jìn)一步驗(yàn)證了Sal是否通過觸發(fā)鐵死亡改善三陰性乳腺癌。將鐵死亡抑制劑Fer-1、DFO和GSH添加到MDA-MB-231細(xì)胞中。結(jié)果顯示，通過使用Fer-1、DFO和GSH等鐵死亡抑制劑處理，Sal對細(xì)胞活性的抑制作用部分得到緩解（圖3F-G）。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇Fer-1進(jìn)行進(jìn)一步研究，它主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)和鐵代謝來抑制鐵死亡。鈣黃綠素-AM/PI染色顯示，通過給予Fer-1處理，細(xì)胞活性抑制部分得到緩解（圖3H）。隨后，添加Fer-1顯著提高了谷胱甘肽（GSH）水平。相比之下，Sal降低了谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性（圖3I-J），丙二醛（MDA）、Fe²⁺和脂質(zhì)活性氧（ROS）水平在Sal組中均顯著增加（圖3K-M）。然而，Sal組中的上述結(jié)果部分被Sal+Fer-1逆轉(zhuǎn)，表明Sal在MDA-MB-231細(xì)胞中誘導(dǎo)鐵死亡。

同時，對于Sal在體內(nèi)的潛在抗癌活性，通過在雌性裸鼠中接種MDA-MB-231細(xì)胞獲得了三陰性乳腺癌動物模型（圖3N）。如圖所示，與單獨(dú)使用Fer-1和聯(lián)合給藥組相比，Sal組的腫瘤生長明顯較慢。Fer-1單獨(dú)給藥組和聯(lián)合給藥組（圖3O-P）。此外，Sal組的腫瘤重量顯著低于其他組（圖3Q）。在治療期間，體重也只有很小的變化，表明這些治療沒有明顯的毒性，并且耐受性良好（圖3R）。此外，腫瘤組織的HE染色結(jié)果顯示，Sal治療組的壞死區(qū)域比其他組大得多（圖3S）。

此外，在施用Sal和Fer-1后，Ki67陽性區(qū)域的上調(diào)比僅接受Sal的區(qū)域更為明顯（圖3S）。所有數(shù)據(jù)表明，Sal可以對抗三陰性乳腺癌而沒有明顯的毒性作用。隨后，與其他組相比，Sal組的谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶活性水平顯著降低，但丙二醛和Fe²⁺水平升高（圖3T-W）。然而，這一結(jié)果與聯(lián)合組的結(jié)果相反。此外，免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sal組中的4-HNE增強(qiáng)，表明Sal促進(jìn)脂質(zhì)過氧化物的積累（圖3X）。同時，在免疫組化分析中，Sal組中PTGS2的陽性表達(dá)升高。這支持了Sal通過誘導(dǎo)鐵死亡在抑制三陰性乳腺癌腫瘤生長中起關(guān)鍵作用的觀點(diǎn)（圖3X）。

圖3

4、共享FRGs的功能富集分析結(jié)果

在Sal和三陰性乳腺癌（TNBC）中鑒定出22個與鐵死亡相關(guān)的基因，這些基因被定義為共享的鐵死亡相關(guān)基因（FRGs）（圖4A）。并進(jìn)行了GO分析顯示（圖4B-C）。

此外，Sal治療三陰性乳腺癌（TNBC）通過觸發(fā)鐵死亡的功效與KEGG富集通路緊密相關(guān)，即脂質(zhì)和動脈粥樣硬化（hsa05417）、mTOR信號通路（hsa04150）、PI3K/AKT信號通路（hsa04151）和自噬-動物（hsa04140）信號通路（圖4D）。這些基因與氧化應(yīng)激、脂質(zhì)和脂肪酸代謝過程、脂質(zhì)生物合成過程以及自噬過程的調(diào)節(jié)密切相關(guān)（圖4E）。

圖4

5、PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵FRGs鑒定

為了研究常見FRGs處的蛋白質(zhì)相互作用，使用STRING在線工具構(gòu)建了一個蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)（圖4F-G）。同時，構(gòu)建了一個藥理網(wǎng)絡(luò)來表示Sal-FRGs-TNBC之間的關(guān)系（圖4H）。使用Cytohubba插件計(jì)算了前15個中心基因（圖4I）。

6、共享FRGs中篩選樞紐特征基因

本研究結(jié)合三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法，從PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的15個樞紐基因中識別出與Sal和TNBC相關(guān)的潛在診斷生物標(biāo)志物。首先，通過LASSO算法獲得了11個生物標(biāo)志物（圖4J-K）。同時，RF算法根據(jù)重要性確定了九個潛在生物標(biāo)志物（圖4L-M）。此外，SVM-RFE分析表明，涉及十個基因（HSPA5、SIRT1、XBP1、MAPK3、GSK3B、HMOX1、HIF1A、IL6、MAPK1和mTOR）的模型實(shí)現(xiàn)了highest的準(zhǔn)確性（圖4N）。最后，三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法交叉識別基因，以獲得候選生物標(biāo)志物，即HIF1A、IL6、mTOR、SIRT1、HMOX1、HSPA5、MAPK3、GSK3B和XBP1（圖4O）。

為了進(jìn)一步研究候選生物標(biāo)志物在三陰性乳腺癌（TNBC）患者中的重要性，分析了上述基因在TNBC患者和正常樣本中的表達(dá)情況。在TCGA-TNBC測試集中，HIF1A、mTOR、HMOX1、HSPA5和GSK3B的表達(dá)水平在TNBC樣本中顯著升高，而IL6、SIRT1、MAPK3和XBP1的表達(dá)降低。這些差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4P）。同時，驗(yàn)證數(shù)據(jù)集GSE61724與上述結(jié)果一致，除MAPK3外，所有基因均表現(xiàn)出一致的趨勢（圖4Q）。此外，驗(yàn)證數(shù)據(jù)集GSE21653的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了SIRT1、MAPK3和XBP1的表達(dá)降低外，其余基因在TNBC患者中均有表達(dá)（圖4R）。此外，使用人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA）數(shù)據(jù)庫中的免疫組化結(jié)果驗(yàn)證了上述基因的表達(dá)。免疫組化結(jié)果與上述結(jié)果一致。除XBP1外，HPA數(shù)據(jù)庫中沒有數(shù)據(jù)。HIF1A、IL6、mTOR、SIRT1、HMOX1、HSPA5、MAPK3和GSK3B在乳腺癌組織中表現(xiàn)出相同的增加趨勢（圖4S）。在TCGA-TNBC數(shù)據(jù)集中，所有基因的AUC值均≥0.6，表明具有極好的診斷價值（圖4T）。同時，在GSE61724和GSE21653驗(yàn)證集中獲得的結(jié)果與上述結(jié)果幾乎一致。在驗(yàn)證集中，所列基因的平均AUC值均≥0.6，除了IL6和HSPA5（圖4U-V）。這些結(jié)果為HIF1A、mTOR、SIRT1、HMOX1、GSK3B、MAPK3和XBP1作為三陰性乳腺癌的診斷生物標(biāo)志物提供了有力證據(jù)。

7、Sal通過調(diào)節(jié)MDA-MB-231細(xì)胞和三陰性乳腺癌動物模型中的PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)鐵死亡

在體外實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）的蛋白表達(dá)水平增加。然而，在Sal組中，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT降低（圖5a），表明Sal觸發(fā)的鐵死亡可能抑制PI3K/AKT通路。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Sal誘導(dǎo)鐵死亡的機(jī)制，應(yīng)用PTEN抑制劑VO-Ohpic三水合物和AKT激活劑SC79，以探索PTEN和AKT在PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)的鐵死亡中的重要作用。結(jié)果表明，VO-Ohpic三水合物和SC79使MDA-MB-231細(xì)胞對Sal誘導(dǎo)的鐵死亡具有抗性（圖5B-C）。除此之外，VO-Ohpic三水合物和SC79還顯著降低了Sal誘導(dǎo)的丙二醛（MDA）并提高了亞鐵水平（圖5D-E）。PI3K只是調(diào)節(jié)AKT激活的眾多機(jī)制之一，此外，VO-Ohpic三水合物可以提高Sal觸發(fā)的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT（圖5F）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果，通過WB檢測了樞紐生物標(biāo)志物mTOR的表達(dá)水平。給予Sal后，p-mTOR/mTOR蛋白顯著下調(diào)（圖5G）。此外，作為mTORC1的底物，p4EBP1/4EBP1在蛋白水平上給予Sal后下調(diào)（圖5G）。之后，應(yīng)用mTORC1激活劑MHY1485和抑制劑雷帕霉素進(jìn)一步探索mTORC1在Sal調(diào)節(jié)的鐵死亡中的作用。結(jié)果表明，MHY1485預(yù)處理賦予細(xì)胞對Sal引起的鐵死亡的抗性，而雷帕霉素增強(qiáng)了Sal誘導(dǎo)的鐵死亡（圖5H-I）。此外，MHY1485大大下調(diào)了Sal調(diào)節(jié)的MDA生成，而雷帕霉素則增加了（圖5J）。Sal誘導(dǎo)的PTGS2蛋白水平升高被MHY1485顯著抑制（圖5K）。上述發(fā)現(xiàn)與預(yù)測結(jié)果一致。PI3K/AKT/mTOR的活性可能與MDA-MB-231細(xì)胞對Sal誘導(dǎo)的鐵死亡敏感性增加有關(guān)。

值得注意的是，鐵死亡PI3K/AKT/mTOR信號通路在體內(nèi)得到了驗(yàn)證。在給予Sal后，PTEN的蛋白水平上調(diào)，而p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR下調(diào)（圖5L）?？傊?，這些結(jié)果表明，Sal可能通過調(diào)節(jié)與mTOR相關(guān)的PI3K/AKT/mTOR通路誘導(dǎo)鐵死亡來改善三陰性乳腺癌。

圖5

8、Sal通過調(diào)節(jié)MDA-MB-231細(xì)胞和三陰性乳腺癌動物模型中mTOR介導(dǎo)的GPX4抗氧化防御誘導(dǎo)鐵死亡

通過RT-PCR和WB方法測量GPX4和PTGS2以測試預(yù)測結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sal可以顯著降低GPX4水平，而PTGS2在mRNA和蛋白質(zhì)水平上增加（圖6A-B）。一致地，mTOR激活劑MHY1485也顯著改善了Sal誘導(dǎo)的GPX4表達(dá)抑制（圖6C）。為了進(jìn)一步研究GPX4是否與Sal調(diào)節(jié)的鐵死亡有關(guān)，在MDA-MB-231細(xì)胞中獲得了GPX4過表達(dá)（圖6D）。與Fer-1給藥一致，通過Sal處理，GPX4過表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞活性抑制得到部分緩解（圖6E，H）。通常，MDA和PTGS2水平顯著下調(diào)（圖6G，I），而由于GPX4過表達(dá)，GPX活性增加（圖6F）。因此，Sal誘導(dǎo)的鐵死亡可能歸因于GPX4的降低。此外，數(shù)據(jù)證實(shí)了在Sal處理的MDA-MB-231細(xì)胞中發(fā)生了鐵死亡，并且Sal觸發(fā)鐵死亡的機(jī)制可能是通過GPX4信號通路調(diào)節(jié)mTOR介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化。

此外，在三陰性乳腺癌動物模型中測試了GPX4信號通路在抗氧化防御過程中的作用。結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)一致。GPX4的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低。相反，Sal處理后PTGS2水平升高（圖6J-K），這表明Sal可以治療三陰性乳腺癌。其機(jī)制可能是通過抑制脂質(zhì)過氧化中mTOR介導(dǎo)的GPX4信號通路來誘導(dǎo)鐵死亡。

圖6

9、Sal通過抑制脂肪酸合成中mTOR介導(dǎo)的SCD1通路在MDA-MB-231細(xì)胞和TNBC動物模型中誘導(dǎo)鐵死亡

Sal處理顯著降低了甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（SREBP1）的mRNA和蛋白質(zhì)水平（圖7A-B）。此外，由于SREBP1影響與脂質(zhì)合成相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，因此檢測了下游相關(guān)基因的mRNA，包括乙酰輔酶A羧化酶（ACACA）、ATP檸檬酸裂解酶（ACLY）、脂肪酸合酶（FASN）和硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）。相比之下，SCD顯著下調(diào)（圖7A）。同時，Sal處理時SCD1的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低（圖7B）。此外，mTOR激活劑MHY1485增加了Sal誘導(dǎo)的SREBP1和SCD1的蛋白質(zhì)表達(dá)（圖7C）。SCD1可以調(diào)節(jié)單不飽和脂肪酸（MUFAs）的生成，與飽和脂肪酸（SFAs）的轉(zhuǎn)化有關(guān)。因此，MDA-MB-231細(xì)胞預(yù)先用單不飽和脂肪酸OA（18:1）和飽和脂肪酸SA（18:0）處理。最后，由于是OA而不是SA，MDA-MB-231細(xì)胞似乎在更大程度上對Sal誘導(dǎo)的鐵死亡具有抗性（圖7D）。通過降低Sal誘導(dǎo)的MDA水平也證實(shí)了這種抑制作用（圖7E）。總體而言，研究結(jié)果表明，Sal抑制了由SCD1產(chǎn)生的單不飽和脂肪酸OA的合成，這是SCD1誘導(dǎo)鐵死亡的主要原因。

為了證明Sal誘導(dǎo)的鐵死亡歸因于硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1），在MDA-MB-231細(xì)胞中構(gòu)建了插入SCD1的過表達(dá)質(zhì)粒（圖7F）。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的SCD1可以增加Sal誘導(dǎo)的細(xì)胞活力（圖7G-H）。同時，在SCD1過表達(dá)時，丙二醛（MDA）和脂質(zhì)活性氧（ROS）水平顯著降低（圖7I-J）。值得注意的是，過表達(dá)的SCD1也抑制了Sal誘導(dǎo)的谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）和前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）的蛋白表達(dá)（圖7K）。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，Sal可能通過抑制脂肪酸合成中mTOR介導(dǎo)的SCD1信號通路促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的鐵死亡。

圖7

10、Sal在MDA-MB-231細(xì)胞和三陰性乳腺癌動物模型中促進(jìn)由mTOR調(diào)節(jié)的NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白自噬

為了進(jìn)一步探索三陰性乳腺癌中自噬相關(guān)通路與鐵死亡之間的關(guān)聯(lián)，檢測了Sal處理后mRNA水平上鐵調(diào)節(jié)蛋白的變化，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TFRC）、鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2（IREB2）、鐵蛋白重鏈（FTH）和NCOA4。觀察到FTHmRNA下調(diào)，NCOA4mRNA顯著上調(diào)，而其他的沒有變化（圖8A），這表明Sal誘導(dǎo)的鐵死亡可能與鐵蛋白自噬相關(guān)。隨后，我們分析了Sal處理后鐵蛋白自噬相關(guān)蛋白水平的變化，包括FTH、NCOA4、P62和LC3II/I。如圖所示，在Sal處理的MDA-MB-231細(xì)胞中，NCOA4和LC3II/I水平上調(diào)，而FTH和P62顯著下調(diào)（圖8B）。令人驚訝的是，mTOR激活劑MHY1485顯著抑制了Sal增加的LC3II/I水平，并改善了Sal降低的P62和FTH蛋白水平（圖8C），這表明Sal激活的鐵蛋白自噬可能是通過抑制mTOR通路實(shí)現(xiàn)的。

此外，為了研究鐵蛋白自噬是否參與了Sal引起的鐵死亡，用3-MA預(yù)處理細(xì)胞以抑制自噬體組裝。結(jié)果顯示，3-MA預(yù)處理顯著提高了細(xì)胞活力，并抑制了Sal誘導(dǎo)的MDA表達(dá)（圖8D-F）。此外，在Sal組中FTH蛋白水平下調(diào)，但在Sal+3-MA組中上調(diào)（圖8G）。接下來，使用針對NCOA4的siRNA來研究NCOA4是否介導(dǎo)Sal觸發(fā)的鐵蛋白自噬，并通過WB證實(shí)轉(zhuǎn)染功效（圖8H）。據(jù)此，選擇siNCOA4#1用于進(jìn)一步研究。敲低NCOA4使MDA-MB-231細(xì)胞抗鐵死亡（圖8I-J），這由下調(diào)的MDA和0ec917b8-67c1-4bf5-8485-1d69dea6857f水平所證明（圖8K-L）。與此一致，敲低NCOA4還抑制PTGS2蛋白水平，同時提高Sal誘導(dǎo)的FTH蛋白水平（圖8M）。所有結(jié)果表明，鐵死亡中自噬相關(guān)傳代是NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白自噬，而Sal誘導(dǎo)的鐵超載可能歸因于由mTOR通路調(diào)節(jié)的NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白自噬。

隨后，一項(xiàng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白自噬和鐵死亡在鹽霉素處理中的作用。三陰性乳腺癌（TNBC）。與對照組相比，鹽霉素組中LC3II/I和NCOA4的水平升高，而P62和FTH顯著降低（圖8N-O）。這與體外結(jié)果一致，表明鹽霉素可能通過mTOR介導(dǎo)的NCOA4調(diào)節(jié)的鐵自噬促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生。

總結(jié)：文章闡明了與鐵死亡密切相關(guān)的TNBC發(fā)病機(jī)制，并確定了TNBC中的潛在生物標(biāo)志物，文章思路非常值得學(xué)習(xí)。傲星生物有豐富的分析方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！